#1. 下载和处理国际上公用公开的数据

这是初二生物学课本里面的一页。

#1.1 HAPMAP3 genotype 数据, 一般作为 LD 计算的 reference panel

打开 https://www.broadinstitute.org/medical-and-population-genetics/hapmap-3， 点击 How To Download This Release 下面的 A. SNP Genotype Data 段落的中间3个链接。 文件名字里面有 "b36"，现在一般都用 b37（比如 UK Biobank），甚至有的用 b38， 所以下载后解压后需要将那个 .map 文件先用 liftOver 转化为 b37 格式，然后用 PLINK 生成 bed/bim/fam 文件。 这个基因数据可供 LDSC 和 GSMR 等软件使用。

#1.2. 1000 genomes (千人基因组) genotype 数据， 一般作为 imputation 的 reference panel.

在千人基因组官网 下载 Phase 3 对应的 VCF 链接， 有一个文件罗列了每一个样本的人群（pop）和人种 (super_pop)，以及性别，可以用PLINK --keep 选取特定人种的样本。 下载下来的数据，有将近一个亿的SNP，每个染色体都是单独的文件。后续跑 GWAS 或提取 PRS 的时候，也是每条染色体的数据分开来跑。 PLINK的网站上也有“1000 genomes phase3” 数据。PLINK 不允许 SNP 名字有重复，可以用下面的命令来处理。

awk '{if(array[$2]=="Y") {i++; $2=$2".DUP"i}; print $0; array[$2]="Y"}' chr1.bim.COPY > chr1.bim 

#2. UKB 基因型和表型数据

阅读 Data access guide 文件，里面会提到如何下载用来下载UKB数据的小软件（比如ukbunpack和unkconv）。 申请得到批准后，从最上面的 Researcher log in 登录后获取。基因型数据我已下载到南科大的HPC上，表型数据见百度网盘上的 ukb50136.enc。 ukbiobank 官网，点击 data showcase --> Essential information --> Accessing UK Biobank data。具体的流程和代码，请见 scripts 文件夹下的 phe.sh, gen.sh 以及 phe.R 和 gen.R。

通过 ukbconv 提取很多列的时候，可以先写一个 MY.fields.txt 文件，列出想提取的变量和对应的 data-field，比如第一行是sex 31，第二行是 age 21022，等。然后用 ukbconv ukb50136.enc_ukb r -iMY.fields.id -oMY 对于表型数据的提取，有一个 ukbtools R软件包。 但不是太好用，并且很慢，可供参考。 用下面的代码将 icd.tab 文件整合为两列，便于读入R。

cat icd.tab | sed -e 's/\tNA//g' -e 's/\t/,/2g' | \
awk '{ if(NR==1) print "IID icd"; else if (NF==1) print $1 " NA"; else print $0"," }' > icd.2cols

#3. GWAS 运行和结果 “挖掘”

#3.1. 专人在服务器上运行

提取需要研究的表型数据和相关的covariates，比如 age, sex, PCs。 一般来说，quantitative的表型数据要 adjust for covariates 和转化成正态分布，这个可以在R里面用下面的命令来实现。

trait_res = residuals(lm(trait ~ age+sex+PC1+PC2, na.action=na.exclude)
trait_inv = qnorm((rank(trait_res,na.last="keep")-0.5) / length(na.omit(trait_res)))

对于疾病的binary 表型，只需要把需要 adjust 的covarites 和表型数据放在同一个表型数据文件里面， 然后在 GWAS里面的plink命令指明哪个是表型，哪些是 covariates。 目前GWAS 由专人负责运行，一般来说就是通过下面这样的PLINK命令来跑

for chr in {1..22}; do
  plink2 --memory 12000 --threads 16 --pfile chr$chr --extract ukb.chr$chr.good.snps --pheno cvd.EUR.pheno --no-psam-pheno --pheno-name XXX --1 --glm cols=+ax,+a1freq,+a1freqcc,+a1count,+a1countcc,+beta,+orbeta,+nobs hide-covar no-x-sex --covar pheno/ukb.cov --covar-name age,sex,PC1-PC10 --out chr$chr   
done

上述命令顺利跑完后，确认生成的文件没有问题后，可以把所有的染色体的数据串到一起，形成一个单一的 XXX.gwas.gz 文件。 最终合并成的 XXX.gwas.gz 文件用 TAB 分割，CHR:POS 排好序，要不然 LocusZoom 那样的软件不能处理。也可以用 tabix -f -S 1 -s 1 -b 2 -e 2 XXX.gwas.gz 对数据进行索引，便于 LocalZoom 那样的软件去处理。

#3.2. 公开的GWAS数据进行练手，或对比

最经典的，起源于美国NIH 的 GWAS Catalog. 这个页面也罗列了一些大型GWAS数据联盟。 欧洲版本，不需要下载就能通过 TwoSampleMR 远程读入。他们提倡 使用 VCF 格式的GWAS文件。

UKB GWAS 完整的分析结果，网上发布

• 美国哈佛大学：http://www.nealelab.is/uk-biobank
• 英国爱丁堡大学：geneatlas: http://geneatlas.roslin.ed.ac.uk
• 哈佛大学的 CVD knowlege portal: https://hugeamp.org/

#3.3. GWAS的管理、 QC、 注释

如果GWAS数据的BETA, SE, P 出现“三缺一” 的情况，可以下面的R代码去寻找“第三者”。 此外，GWAS文件必须按照CHR和POS排好序，可用sort -k 1,1V -k 2,2n来实现，-V是为了把chrX和chrY排到最后，但是需要把第一行先写到新文件里。

b  = se * qnorm(p/2)
se = abs(b/qnorm(p/2))
se = (CI_upper - CI_lower)/(1.96*2)
p  = 2*pnorm(-abs(b/se))

可使用密西根大学开发的Pheweb 流水线作业。日本版本pheweb.jp。中国版本的是本课题组建立的 pheweb.cn。 Pheweb有一个强大的add_rsids.py 的功能，但是存在先天缺陷。根据该聊天记录，用户可以在安装pheweb 后找到 add_rsids.py 文件（find /home/ -name "add_rsid*" 或者 pip show --files pheweb），修改一行代码（第140行）。。

修改前：rsids = [rsid['rsid'] for rsid in rsid_group if cpra['ref'] == rsid['ref'] and are_match(cpra['alt'], rsid['alt'])]
修改后：rsids = [rsid['rsid'] for rsid in rsid_group if (cpra['ref'] == rsid['ref'] and are_match(cpra['alt'], rsid['alt'])) or (cpra['ref'] == rsid['alt'] and are_match(cpra['alt'], rsid['ref']))]

用户也可以在得到pheweb网站上的 rsids-v154-hgXX.tsv.gz 文件（7亿多行）后，在本Github的 scripts文件夹下载本课题组修订的 add_rsid.py，dos2unix add_rsid2.py，然后运行如下示例命令。注意:--sep 后面有双引号。

python add_rsid.py -i test.tsv --sep "\t" --chr CHR --pos POS --ref NEA --alt EA -d files/dbsnp/rsids-v154-hg19.tsv.gz -o out.tsv

通过LD的计算来找到GWAS数据里面的independent top hits，也有一些问题。比如，g1k的LD不是金标准，r2也不是最合理的筛选办法，并且计算量很大。如果不考虑 SNP之间的LD，只考虑距离，假设GWAS的第1，2，3 列分别是 SNP, CHR, POS，最后一列是P，可以用下面这个简单的代码来寻找GWAS数据里面每1MB区间的top SNP。

zcat ABC.gwas.gz | awk 'NR==1 || $NF<5e-8 {b=sprintf("%.0f",$3/1e6); print $1,$2,$3,$NF,b}' | \
	sort -k 2,2n -k 5,5n -k 4,4g | awk '{if (arr[$NF] !="Y") print $0; arr[$NF] ="Y"}' 

要把上述得到的显著区域跟已发表的文章中的SNP进行比较，看是不是有重叠（1MB范围之内的重叠都算），可以用 bedtools。

#4. GWAS 及 post-GWAS分析

#4.1 GWAS 功能（function）分析

可先尝试傻瓜相机式的FUMA 网上解读系统，见参考文献

#4.2 多基因风险评分PRS

相关的方法学，请参考经典版的 PLINK0.9 和新版的 PLINK1.9

#4.3. 因果分析 Mendelian Randomization

如果有个体数据数据，可以采用 GSMR，参考GSMR 文章 。 如果没有个体数据，只有别人报道的 exposure 和 outcome 的 BETA 和 SE，就可以使用Bristol大学开发的TwoSampleMR R包或剑桥大学团队开发的MendelianRandomization R包。 前者有非常强大的数据调取和数据管理功能，而后者比较简单直观。

# 参考文献和网站

基因注释信息浏览器：

• 非常经典的 dbSNP: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/
• 非常经典的 UCSC genome browser: https://www.genome.ucsc.edu/
• 美国精准医学All of Us：https://www.researchallofus.org/ 和 https://databrowser.researchallofus.org/
• 密西根大学公卫学院 TopMed browser: https://bravo.sph.umich.edu/
• 一天发了7篇 NATURE系列文章的Gnomad项目的 browser: https://gnomad.broadinstitute.org/
• 带”Global“的 GlobalBiobankEngine：https://github.com/rivas-lab

理论学习

进化对人类疾病的影响：

• Y 2021. Nature Review Genetics. The influence of evolutionary history on human health and disease
• Y 2023. Science Bulletin. Recent positive selection signatures reveal phenotypic evolution in the Han Chinese population

GWAS-PRS-MR ”三驾马车“ 入门：

GWAS:

• Y 2006. Nature Review Genetics. A tutorial on statistical methods for population association studies
• Y 2014. Nature Protocols. Quality control and conduct of genome-wide association meta-analyses
• Y 2021. Nature Reviews Methods Primers. Genome-wide association studies
• 芬兰赫尔辛基大学 GWAS 课程

PRS:

• Y 2019. Lancet Respiratory Medicine. Identification of risk loci and a polygenic risk score for lung cancer: a large-scale prospective cohort study in Chinese populations
• Y 2020. Nature Protocols. Tutorial: a guide to performing polygenic risk score analyses
• Y 2022. EHJ. A polygenic risk score improves risk stratification of coronary artery disease: a large-scale prospective Chinese cohort study
• Y 2023. Nature Medicine. A multi-ancestry polygenic risk score improves risk prediction for coronary artery disease

MR：

• Y 2012. 经典案例 Lancet. Plasma HDL cholesterol and risk of myocardial infarction: a mendelian randomisation study
• Y 2017. 一篇解读我的PRIMe方法的文章 Ele Zeggini. Statistical methods to detect pleiotropy in human complex traits
• Y 2021. 通过MR进行中介分析 Mendelian randomisation for mediation analysis: current methods and challenges for implementation
• Y 2022. 入门必读 Nature Reviews Methods Primers. Mendelian randomization
• Y 2023. 一篇非常简单的JAMA子刊 JAMA Psychiatry. Association of Genetically Predicted Insomnia With Risk of Sepsis

一些有用、有趣的实用工具：

• The R Graph Gallery
• Doing and reporting your first mediation analysis in R
• Add P-values and Significance Levels to ggplots
• Top 100 R resources on COVID-19 Coronavirus
• 以及 scitb, CanvasXpress, modelSummary, forplo，sankey diagram, CellChat, ComplexHeatmap，等等

代码中的数字揭秘：

• X2Y: X到Y
• Y4x: Y中数据中为(for)了X的部分，里面并没有X的数据，因此小写x。
• dat0 原始数据，很大，不要多次读取； dat正常分析用的数据； dat1 临时数据，在loop里面使用，要不然在loop外面和里面都用dat，会出问题。